上海安亭科學(xué)儀器廠在本文中介紹離心機(jī)在五苓散同方湯劑缺失化學(xué)成分藥效的研究中的應(yīng)用，文中先從本次實(shí)驗(yàn)所需要的實(shí)驗(yàn)材料儀器出發(fā)，并簡(jiǎn)單介紹下實(shí)驗(yàn)方法，闡明五苓方小劑量散劑臨床療效遠(yuǎn)強(qiáng)于其大劑量湯劑即五苓方宜散不宜湯的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)五苓方臨床應(yīng)用的劑型選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1、實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：大鼠，SPF 級(jí)，體重 180 ~ 200 g，雄性，56 只，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) ：SCXK（遼）2015-0001，合格證編號(hào) ：211002300010439，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件，溫度：28 ~ 30 ℃ ,相對(duì)濕度 ：（55±5）%，光照 ：12 h /d。
2、所需要儀器設(shè)備
23- 乙酰澤瀉醇 B（111846-201203）、香豆素（111739-200501）、 麥 角 甾 醇（111846-201203）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院 ；氫氯噻嗪（簡(jiǎn)稱(chēng)HCT， CAS 號(hào) ：58-93-5，SIGMA-ALDRICH），AQP1（PB0498）、AQP2 （BA0649）、AQP4 （PB0500） 抗體及羊抗兔抗體（KGAA35）均購(gòu)自博士德生物技術(shù)有限公司 ；全蛋白提取試劑盒（中國(guó) 江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司 KGP250）；SDP-PAGE 凝膠電泳試劑盒（中國(guó) 江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公 司 KGP113），Western Blotting 檢 測(cè) 試 劑 盒（ 中國(guó) 江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司 KGP1201）；ECL 檢測(cè)試劑盒（中國(guó)江蘇凱基生物科技發(fā)展有限 公 司 KGP1123）；Trizol（ 美 國(guó) Invirrogen 15596-026）；cDNA 第一鏈合成試劑盒（美國(guó) Thermo FisherK1622）等。Real time PCR Master Mix （日本 TOYOBO）；高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠TGL-20bR）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek EL-x800）；熒光定量 PCR 循環(huán)儀（美國(guó) ABIStep one plus Real time-PCR system）；分析天平（德國(guó) Sartorius BL310/BL21S）等。
3、實(shí)驗(yàn)方法
將篩選合格的48只大鼠，分為6組，每組8只。正常大鼠的鹽水負(fù)荷模型參考文獻(xiàn)方法，并相應(yīng)改進(jìn)。正常組 ：無(wú)處理，自由飲水 ；模型組 ：灌胃1 % 的鹽水 2.5 ml ；麥角甾醇組（35 mg/kg）：灌胃與含有麥角甾醇的等量鹽水 ；香豆素組（50 mg/kg）：灌胃與含有香豆素的等量鹽水 ；23- 乙酰澤瀉醇B組（50mg/kg）：灌胃與含有23- 乙酰澤瀉醇 B 的等量鹽水 ；氫氯噻嗪組（10mg/kg）：灌胃與含有氫氯噻嗪的等量鹽水。每只代謝籠放 1 只大鼠，給藥體積為 25 ml/kg， 1 次 /d，連續(xù)灌胃給藥 8 d，給藥第 1 天及第 7 天將大鼠置于代謝籠內(nèi)收集給藥后 6 h 內(nèi)的尿液，并記錄尿液體積 ；第8天給藥1h后，按50mg/kg，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，取腎臟，一份置于液氮罐中速凍后，置 -80℃冰箱保存 ；一份固定保存。檢測(cè)指標(biāo) ：尿量及腎臟 AQP1、AQP2、AQP4 mRNA 和蛋白表達(dá)。
Real-time PCR 檢 測(cè) AQP1、AQP2 和 AQP4mRNA 的表達(dá)，按 Trizol 試劑說(shuō)明提取細(xì)胞總 RNA，采用 MMLV逆轉(zhuǎn)率試劑盒操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄 cDNA，在 95 ℃ 10min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 cycles 反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光定量 PCR 反應(yīng)。結(jié)果以 qrGAPDH 為內(nèi)參，采用 2 -ΔΔCT SD 法進(jìn)行結(jié)果分析，將各組 RQ 值（RQ = 2 -ΔΔCT SD）進(jìn)行比較。
統(tǒng)計(jì)分析 ：使用 Gel-Pro32 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析 ；實(shí)時(shí)熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用 2 -ΔΔCT 的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 20.0 分析軟件進(jìn)行分析，組間比較采用ANOVA 單因素方差分析，采用 LDS t-test 分析方法進(jìn)行兩兩比較，P ＜ 0.05 認(rèn)為有顯著差異，P ＜ 0.01認(rèn)為有極顯著差異。
以上內(nèi)容僅供大家參考。
掃一掃進(jìn)入手機(jī)官網(wǎng)
掃一掃關(guān)注我們
